Современные подходы к диагностике гемостаза (3)

Третий этап – аналитический

    На этом этапе важную роль играют: выбор аналитических методов, каче­ство используемого оборудования и реагентов. Одной из основных причин низ­кого качества проводимых исследований часто является применение устарев­ших, мало точных методик (время рекальцификации, β-нафтоловый тест, аутокоагуляционный тест и др.). Определение концентрации фибриногена, на­пример, основывается в большинстве лабораторий на весовом методе Рутберг, низкая надежность которого известна. В современной лаборатории для выпол­нения этого исследования следует применять метод Клаусса с использованием современного коагулометра.

   Встречается также неоднозначная оценка результатов отдельных показате­лей коагулограммы. К примеру, результаты протромбинового теста выражают сегодня в четырех вариантах, что мало способствует стандартизации этой базо­вой методики. Во всем мире принято выражать результаты этого теста в процен­тах по Квику (по калибровке, построенной на разведениях контрольной нор­мальной плазмы) и в международном нормализованном отношении (MHO), используемом в соответствии с рекомендациями ВОЗ (1983) при контроле за применением антикоагулянтов непрямого действия. Это не только необходимые элементы стандартизации, но и возможность реально снизить число геморраги­ческих осложнений от передозировки антикоагулянтов непрямого действия.

   Ниже мы приводим краткий обзор современных методов исследования по­казателей системы гемостаза и применяемого для этого оборудования.

Клоттинговые методы исследования плазменного гемостаза

   Клоттинговые методы исследования плазменного гемостаза относятся к наиболее широко используемым методам диагностики свертывающей системы крови. Данные методы основаны на регистрации времени образования фибринового сгустка. В зависимости от присутствия в реакционной пробе тех или иных активаторов или ингибиторов, добавляемых при проведении исследова­ния, можно оценивать активность отдельных звеньев или путей плазменного гемостаза. Клоттинговые методы позволяют выполнять исследования протром­бинового теста (протромбиновое отношение, по Квику, MHO), определение концентрации фибриногена, АЧТВ, тромбинового теста, антитромбина III, определение активности VIII и IX факторов свертывающей системы, определе­ние волчаночного антикоагулянта и др.

   Производство стандартизованных готовых форм реагентов и контрольных материалов, а также применение коагулометров сделало клоттинговые исследования быстрыми, точными, воспроизводимыми и, следовательно, информативными для клиники.

    Более того, стали доступны новые современные методики, основанные на использовании малых количеств биологических жидкостей и исследовании не­посредственно капиллярной цельной крови, что сейчас очень актуально и для детских отделений, и для пациентов, подвергающихся постоянному мониторин­гу свертывающей системы. Поэтому применение коагулометра не просто повы­шает правильность и воспроизводимость коагулологических исследований, но в большой степени расширяет диагностические возможности лаборатории.

Учитывая разнообразие клоттинговых тестов, к коагулометру предъявля­ются определенные требования:

- достаточная чувствительность при работе с сильно разведенными плаз­мами и плазмами с низким содержанием фибриногена (для определения активности антитромбина III, факторов VIII и IX, концентрации фибрино­гена по Клауссу, диагностике нарушений в системе протеина С и др.);

- возможность проводить исследования как на плазме, так и на цельной крови (для протромбинового времени и расчета MHO, при условии ис­пользования правильной методики забора капиллярной крови и примене­ния реагентов, специально разработанных для исследования капиллярной крови (например, тест "Техпластин К" компании "Технология Стандарт");

- способность работать с реагентами разных производителей.
 

Исследование агрегации тромбоцитов

   Диагностика функционального состояния тромбоцитов, а также определе­ние содержания фактора Виллебранда в плазме осуществляется на агрегометре. Без исследования агрегации тромбоцитов невозможно обойтись при диагно­стике нарушений тромбоцитарного гемостаза и геморрагической мезенхимальной дисплазии, диагностике тромбозов, тромбоэмболии и ДВС-синдрома, идентификации гематогенных тромбофилий, дифференциальной диагностике нарушений в системе протеина С, диагностике гиперкоагуляционного синдро­ма (синдрома вязких тромбоцитов), контроле за лечением антиагрегантами. Причем в ряде случаев необходимо оценить спонтанную агрегацию и агрегацию малыми дозами индуктора. Не каждый агрегометр позволяет это сделать.

Методы с хромогенными субстратами

   Ряд факторов свертывающей и противосвертывающей систем гемостаза являются ферментами. Очевидно, что эти факторы можно исследовать по их ферментативной активности. Для этого нужно к конкретному фактору подо­брать такой субстрат, чтобы в результате ферментативной реакции образова­лось вещество, хорошо поглощающее свет в видимой области спектра. По ско­рости образования этого вещества можно судить о ферментативной активности фактора. На этом принципе основаны методы определения активности анти­тромбина III, факторов VIII и IX, определение плазминогена и α2-антиплазмина.

Для методов с хромогенными субстратами разработаны специальные набо­ры с указанием методики определения.
 

Количественная оценка форменных элементов крови

    Для оценки системы гемостаза наибольший интерес представляет значение концентрации тромбоцитов в крови пациента. К сожалению, как раз именно этот показатель ручными методами определяется наименее точно. Не вызывает сомнения, что любая лаборатория сегодня должна отказаться от ручного под­счета клеток крови. Определение этих показателей с помощью гематологиче­ского анализатора экономит во много раз время на исследование и обеспечива­ет получение точных результатов. Гематологические анализаторы открывают путь к получению совершенно новых диагностических данных.

Иммуноферментный анализ

   Большинство факторов свертывающей и противосвертывающей систем яв­ляются белковыми соединениями, к которым могут быть получены антитела и соответственно созданы ИФА-наборы. Иммуноферментный метод позволяет определять концентрацию некоторых факторов системы гемостаза, например антитромбина III, содержание в крови продуктов, образующихся в результате функционирования этих факторов, в частности продуктов деградации фибри­ногена и Д-димеров, определение антител к кардиолипину и фосфатидилсерину при диагностике антифосфолипидного синдрома и др. Использование методов ИФА предполагает оснащение  лаборатории иммуноферментным фотометром, инкубатором-встряхивателем, промывающим устройством и дозаторами для ИФА.
 

ДНК-диагностика методом полимеразной цепной реакции

   Ряд нарушений в системе гемостаза обусловлены дефектами генов, коди­рующих факторы свертывающей системы крови. Для диагностики этих нару­шений следует применять методы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данные исследования очень важны и являются ключевыми при диагностике тромбофилий, которые протекают без значительных нарушений функции тех или иных звеньев системы гемостаза, например при аномалиях протромбина и факторов VII и VIII. Они важны также для разграничения генетически обуслов­ленных и вторичных (симптоматических) форм этой патологии, в частности наследственной и приобретенной резистентности  к активированному протеину С.

А.Н.Шибанов

канд. физ.-мат. наук, генеральный секретарь РАМЛД, член правления РАПСКЛД, генеральный директор А/О Юнимед



                                                                                                           продолжение следует