Современные подходы к диагностике гемостаза (3)
Третий этап – аналитический
На этом этапе важную роль играют: выбор аналитических методов, качество используемого оборудования и реагентов. Одной из основных причин низкого качества проводимых исследований часто является применение устаревших, мало точных методик (время рекальцификации, β-нафтоловый тест, аутокоагуляционный тест и др.). Определение концентрации фибриногена, например, основывается в большинстве лабораторий на весовом методе Рутберг, низкая надежность которого известна. В современной лаборатории для выполнения этого исследования следует применять метод Клаусса с использованием современного коагулометра.
Встречается также неоднозначная оценка результатов отдельных показателей коагулограммы. К примеру, результаты протромбинового теста выражают сегодня в четырех вариантах, что мало способствует стандартизации этой базовой методики. Во всем мире принято выражать результаты этого теста в процентах по Квику (по калибровке, построенной на разведениях контрольной нормальной плазмы) и в международном нормализованном отношении (MHO), используемом в соответствии с рекомендациями ВОЗ (1983) при контроле за применением антикоагулянтов непрямого действия. Это не только необходимые элементы стандартизации, но и возможность реально снизить число геморрагических осложнений от передозировки антикоагулянтов непрямого действия.
Ниже мы приводим краткий обзор современных методов исследования показателей системы гемостаза и применяемого для этого оборудования.
Клоттинговые методы исследования плазменного гемостаза
Клоттинговые методы исследования плазменного гемостаза относятся к наиболее широко используемым методам диагностики свертывающей системы крови. Данные методы основаны на регистрации времени образования фибринового сгустка. В зависимости от присутствия в реакционной пробе тех или иных активаторов или ингибиторов, добавляемых при проведении исследования, можно оценивать активность отдельных звеньев или путей плазменного гемостаза. Клоттинговые методы позволяют выполнять исследования протромбинового теста (протромбиновое отношение, по Квику, MHO), определение концентрации фибриногена, АЧТВ, тромбинового теста, антитромбина III, определение активности VIII и IX факторов свертывающей системы, определение волчаночного антикоагулянта и др.
Производство стандартизованных готовых форм реагентов и контрольных материалов, а также применение коагулометров сделало клоттинговые исследования быстрыми, точными, воспроизводимыми и, следовательно, информативными для клиники.
Более того, стали доступны новые современные методики, основанные на использовании малых количеств биологических жидкостей и исследовании непосредственно капиллярной цельной крови, что сейчас очень актуально и для детских отделений, и для пациентов, подвергающихся постоянному мониторингу свертывающей системы. Поэтому применение коагулометра не просто повышает правильность и воспроизводимость коагулологических исследований, но в большой степени расширяет диагностические возможности лаборатории.
Учитывая разнообразие клоттинговых тестов, к коагулометру предъявляются определенные требования:
- достаточная чувствительность при работе с сильно разведенными плазмами и плазмами с низким содержанием фибриногена (для определения активности антитромбина III, факторов VIII и IX, концентрации фибриногена по Клауссу, диагностике нарушений в системе протеина С и др.);
- возможность проводить исследования как на плазме, так и на цельной крови (для протромбинового времени и расчета MHO, при условии использования правильной методики забора капиллярной крови и применения реагентов, специально разработанных для исследования капиллярной крови (например, тест "Техпластин К" компании "Технология Стандарт");
- способность работать с реагентами разных производителей.
Исследование агрегации тромбоцитов
Диагностика функционального состояния тромбоцитов, а также определение содержания фактора Виллебранда в плазме осуществляется на агрегометре. Без исследования агрегации тромбоцитов невозможно обойтись при диагностике нарушений тромбоцитарного гемостаза и геморрагической мезенхимальной дисплазии, диагностике тромбозов, тромбоэмболии и ДВС-синдрома, идентификации гематогенных тромбофилий, дифференциальной диагностике нарушений в системе протеина С, диагностике гиперкоагуляционного синдрома (синдрома вязких тромбоцитов), контроле за лечением антиагрегантами. Причем в ряде случаев необходимо оценить спонтанную агрегацию и агрегацию малыми дозами индуктора. Не каждый агрегометр позволяет это сделать.
Методы с хромогенными субстратами
Ряд факторов свертывающей и противосвертывающей систем гемостаза являются ферментами. Очевидно, что эти факторы можно исследовать по их ферментативной активности. Для этого нужно к конкретному фактору подобрать такой субстрат, чтобы в результате ферментативной реакции образовалось вещество, хорошо поглощающее свет в видимой области спектра. По скорости образования этого вещества можно судить о ферментативной активности фактора. На этом принципе основаны методы определения активности антитромбина III, факторов VIII и IX, определение плазминогена и α2-антиплазмина.
Для методов с хромогенными субстратами разработаны специальные наборы с указанием методики определения.
Количественная оценка форменных элементов крови
Для оценки системы гемостаза наибольший интерес представляет значение концентрации тромбоцитов в крови пациента. К сожалению, как раз именно этот показатель ручными методами определяется наименее точно. Не вызывает сомнения, что любая лаборатория сегодня должна отказаться от ручного подсчета клеток крови. Определение этих показателей с помощью гематологического анализатора экономит во много раз время на исследование и обеспечивает получение точных результатов. Гематологические анализаторы открывают путь к получению совершенно новых диагностических данных.
Иммуноферментный анализ
Большинство факторов свертывающей и противосвертывающей систем являются белковыми соединениями, к которым могут быть получены антитела и соответственно созданы ИФА-наборы. Иммуноферментный метод позволяет определять концентрацию некоторых факторов системы гемостаза, например антитромбина III, содержание в крови продуктов, образующихся в результате функционирования этих факторов, в частности продуктов деградации фибриногена и Д-димеров, определение антител к кардиолипину и фосфатидилсерину при диагностике антифосфолипидного синдрома и др. Использование методов ИФА предполагает оснащение лаборатории иммуноферментным фотометром, инкубатором-встряхивателем, промывающим устройством и дозаторами для ИФА.
ДНК-диагностика методом полимеразной цепной реакции
Ряд нарушений в системе гемостаза обусловлены дефектами генов, кодирующих факторы свертывающей системы крови. Для диагностики этих нарушений следует применять методы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данные исследования очень важны и являются ключевыми при диагностике тромбофилий, которые протекают без значительных нарушений функции тех или иных звеньев системы гемостаза, например при аномалиях протромбина и факторов VII и VIII. Они важны также для разграничения генетически обусловленных и вторичных (симптоматических) форм этой патологии, в частности наследственной и приобретенной резистентности к активированному протеину С.
А.Н.Шибанов
канд. физ.-мат. наук, генеральный секретарь РАМЛД, член правления РАПСКЛД, генеральный директор А/О Юнимед
продолжение следует